文獻｜水稻雙負調控抗逆性

      水稻是全球最重要的糧食作物之一，而乾旱是影響水稻產量最重要的關鍵因子，因此，提高水稻自身的抗旱能力，是科學家一直在研究的話題。身為客製化抗體專家公司之一的 ”ABclonal” 則是利用本身經驗豐富的客製化抗體技術的經驗，成功做出協助學者找到水稻抵抗乾旱的關鍵因子。

• 題目：Abscisic acid inhibits rice protein phosphatase PP45 via H2O2 and relieves repression of the Ca2+/CaM-dependent protein kinase DMI3
• 期刊：Plant Cell
• 單位：南京農業大學
• 物種：水稻
• 應用：WB Co-IP
• ABclonal合作技術：DMI3、PP45和DMI3T263(p)抗體定制

一、研究背景

水稻是全球重要糧食作物，也是用水量最多的作物。水稻淹水栽培耗水量巨大，乾旱影響水稻生長，導致作物減產，若干旱持續發生，災情發展就更加嚴重。提高水稻自身抗旱能力，是農業科學家一直研究的問題。

前期研究表明水分脅迫是限制植物生長發育、影響作物產量的至關重要的脅迫因子。植物響應水分脅迫的最重要的反應之一是迅速積累植物激素脫落酸（ABA）。 ABA能夠通過誘導氣孔關閉、調節基因表達、誘導滲透調節物質的積累以及增強抗氧化防護來提高植物響應環境脅迫的能力，也就是說能夠提高水稻在缺水情況下的生存能力。

Ca2+是ABA信號轉導中的重要的第二信使，而CCaMK（Ca2+/CaM依賴型蛋白激酶）是Ca2+的感受器之一。受ABA信號活化的CCaMK（DMI3）可以增強水稻抵抗水分脅迫和氧化脅迫的能力。然而，ABA活化DMI3的機理尚不清楚。

南京農業大學生命科學學院蔣明義教授課題組在國際權威學術期刊The Plant Cell發表了題為“Abscisic acid inhibits rice protein phosphatase PP45 via H2O2and relieves repression of the Ca2+/CaM-dependent protein kinase DMI3”研究論文，該研究報導了水稻中ABA信號轉導的一個正調控因子CCaMK被ABA活化的機理，與此同時，The Plant Cell以“A partnership for ABA responses”為題發表編輯評論，將該工作作為亮點予以介紹。

二、研究內容及結果

 1、DMI3與蛋白磷酸酶PP45存在互做
研究團隊通過酵母雙雜篩選找到一個DMI3的互作蛋白--蛋白磷酸酶PP45，進一步通過GST pull-down，雙分子熒光互補BiFC和​​免疫共沉澱Co-IP實驗在體內和體外同時證明DMI3和PP45存在互做，並定位於細胞核。

Figure 1. PP45 Interacts with DMI3 both In Vitro and In Vivo

2、ABA和H2O2抑制PP45與DMI3互作
體外通過酵母雙雜交和pull-down實驗表明，PP45與DMI3相互作用受到H2O2的阻止，但ABA並不影響互作；通過內源性Co-IP實驗發現H2O2與ABA都會阻止PP45與DMI3的互作。通過CRISPR/Cas9基因敲除實驗證實ABA信號通路誘導產生的H2O2的確在體內直接影響互作，表明ABA在體內通過誘導H2O2的產生影響互作。

Figure 2. ABA and H₂O₂ Inhibit the Interaction of PP45 and DMI3.

3、ABA和H2O2暫短下調PP45蛋白表達
在ABA、H2O2的處理過程中，PP45的表達量與活性均發生明顯的下調。尤其是一系列的活性測試證明，磷酸化活性是PP45受到最嚴重影響的活性。

Figure 3. ABA and H₂O₂ Transiently Down-Regulate PP45

4、PP45負調節DMI3 自磷酸化活性
通過選擇位點、驗證去磷酸化等一系列實驗，表明在ABA 信號轉導中，PP45 作用於DMI3 的Thr263位點，負調節DMI3 自磷酸化活性，進而去磷酸化DMI3。點突變實驗表明Thr-263去磷酸化的DMI3無法結合下游調控因子CaM，進而降低水稻抵抗水分脅迫和氧化脅迫的能力。

Figure 4. Thr-263 Autophosphorylation Is Required for the Activation of DMI3 and the Response Mediated by DMI3

5、PP45形成二聚體失活釋放DMI3 

進一步研究發現ABA一方面降低PP45的基因表達，從而使PP45蛋白含量降低，更重要的一方面是ABA誘導產生H2O2，H2O2作用於PP45的Cys350和Cys428，使其形成分子間二硫鍵，導致PP45形成二聚體而失活。失活的PP45釋放DMI3，使DMI3自磷酸化，自磷酸化的DMI3結合CaM磷酸化底物從而轉導傳遞ABA信號。

Figure 5. PP45^C350S/C428S Abolishes the Effect of H₂O₂ on the DMI3-PP45 Interaction and on PP45-Mediated Inactivation of DMI3

三、總結

該研究結果揭示了DMI3 在ABA 信號轉導中的一個新的互作蛋白PP45，闡明ABA 信號轉導中DMI3 與PP45 的互作機制，進而揭示ABA 信號轉導中一條新的DMI3 活化途徑。這一研究的開展不僅有助於人們對植物細胞CCaMK參與植物抗逆反應的功能與作用機制的認識，進而拓展人們對逆境下ABA 信號轉導機理的理解，而且對於利用分子生物學手段提高作物的耐逆性具有重要的指導意義。

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