題目：PPARγ preservation via promoter demethylation alleviates osteoarthritis
in mice
期刊：Annals of the Rheumatic Diseases《風濕病年鑑》
產品：DNMT3a和DNMT3b (貨號：A3169和A7239)
物種：人和小鼠
應用：WB IHC
一、研究背景
骨關節炎(Osteoarthritis, OA)為多種病因如肥胖、性別差異、關節勞損、創傷、先天性遺傳缺陷等引起的骨關節軟骨和關節下骨退行性病變，是中老年人最常見的骨關節疾病，60歲後男女患病率分別高達10%及18%，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、僵硬、腫脹、活動受限和關節畸形，缺乏有效藥物治療，嚴重患者需行關節置換手術。在細胞水平，骨關節炎的發生髮展與氧化應激失衡，過度炎症反應，以及軟骨細胞合成，分解代謝相關蛋白表達異常密切相關。儘管許多患者俱有類似的病理誘因，但罹患骨關節炎的易感性，病情嚴重程度及對治療的反應不一，影響病情，療效和預後的判斷。近來眾多研究表明表觀遺傳DNA甲基化異常能夠導致骨關節炎相關蛋白表達紊亂，部分解釋了骨關節炎發病和病程的個體差異，但這些病理改變是骨關節炎的誘因或是結果，以及哪些表觀遺傳敏感基因控制骨關節炎的發生髮展依舊不明。
基因轉錄子PPARγ是核激素受體家族成員，廣泛分佈於各種組織細胞，主要參與調控脂肪組織分化和代謝，同時也是重要的骨關節保護蛋白。 PPARγ啟動子含有經典的CpG島，是表觀遺傳DNA甲基化修飾的敏感位點，但PPARγ是否在骨關節炎發生髮展中受表觀遺傳DNA甲基化異常調控及功能相關性尚無報導。
南京大學醫學院曹望森教授和蔣青教授（共同通訊作者）在骨關節炎表觀遺傳病理機制研究中取得重要進展，研究成果榮登國際風濕病及骨關節炎學科原創研究排名第一雜誌Annals of the Rheumatic Diseases《風濕病年鑑》。該研究揭示了骨關節炎表觀遺傳DNA甲基化異常的關鍵調控通路和基因靶點，為進一步研發靶向DNMT/PPARγ通路的有效製劑治療骨關節炎和相關疾病提供新的理論指導。該論文第一作者為朱曉波碩士，博士研究生陳芳，陸克和韋噯提供了轉基因小鼠等技術支持。
二、研究內容及結果
➤1、 PPARγ對OA發展至關重要以及在OA患者和DMM小鼠的關節軟骨中受到抑制
研究人員對骨關節炎患者和小鼠膝關節內側半月板失穩術DMM (destabilization of medial meniscus)造模的骨關節炎關節軟骨採用WB檢測發現PPARγ蛋白水平明顯下降，與此同時OA患者中導致軟骨退化的主要酶MMP13和Adamts5表達上升，軟骨基質蛋白Aggrecan表達下降，這與預測結果一致。與野生型小鼠相比，PPARγ基因敲除小鼠的骨關節炎損傷更加嚴重。這些結果表明PPARγ對OA有保護作用，其在關節軟骨中的抑制與OA的發展密切相關。
➤2、DNMT1和DNMT3a表達上調引起PPARγ啟動子超甲基化導致PPARγ下調
採用MSP（Methylation specific PCR）和BSP（Bisulfite sequencing PCR）技術進一步檢測PPARγ下降的上下游病理過程/信號通路，發現在OA病人和DMM小鼠關節軟骨中PPARγ啟動子呈現DNA超甲基化。 WB和IHC免疫學實驗證實DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase) DNMT1和DNMT3a特異性表達上升。
➤3、5Aza恢復PPARγ平衡IL-1β引起氧化應激以及過度的炎性反應
體外培養的軟骨細胞和小鼠骨關節研究證實DNMT1/3a抑製劑5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷(5Aza, 5-Aza-2'-deoxycytidine) 能夠有效去除IL-1β及DMM誘導的PPARγ啟動子超甲基化，緩解PPARγ下調及相關的氧化應激失衡和過度的炎症反應，
改善骨關節炎相關蛋白的表達和骨關節損傷。
➤4、PPARγ通過5Aza在體內對軟骨有至關重要的保護作用
進一步對野生型小鼠和PPARγ基因敲除小鼠的比較研究表明藥理性抑制DNMT1/3a能夠顯著的緩解野生型小鼠的骨關節炎病理改變，但對PPARγ基因敲除小鼠的保護作用不明顯，說明PPARγ是骨關節炎表觀遺傳DNA甲基化紊亂病理機制中的關鍵效應蛋白，其上游DNMT1/3a的異常升高能夠導致PPARγ啟動子超甲基化及PPARγ表達下降，降低了PPARγ拮抗骨關節氧化應激失衡和過度炎症反應能力，最終誘導並加重骨關節炎的發生發展。
文章小結
這些研究結果表明DNMT1/3a/PPARγ軸在表觀遺傳失常和關節炎發生發展中起重要作用，揭示了骨關節炎表觀遺傳DNA甲基化異常的關鍵調控通路和基因靶點，提示由於家庭遺傳或環境因素，過去疾病或服藥史導致該通路相關基因表達失常有可能增加罹患骨關節炎的風險或加重骨關節炎病程。該研究還為進一步研發靶向DNMT/PPARγ通路的有效製劑治療骨關節炎和相關疾病提供新的理論指導。
三、表觀抗體案例展示
參考文獻
1. Glyn-Jones s, Palmer aJr, agricola r, et
al. osteoarthritis. The Lancet 2015;386:376–87.
2. Chu CR, Millis MB, olson sa.
osteoarthritis: from palliation to prevention: aoa critical issues. J Bone
Joint Surg Am 2014;96:e130.
3. Wang M, shen J, Jin H, et al. recent
progress in understanding molecular mechanisms of cartilage degeneration during
osteoarthritis. Ann N Y Acad Sci 2011;1240:61–9.
4. Reynard ln. analysis of genetics and Dna
methylation in osteoarthritis: what have we learnt about the disease? Semin
Cell Dev Biol 2017;62:57–66.
5. Lev Maor G, Yearim a, ast G. The
alternative role of Dna methylation in splicing regulation. Trends in Genetics
2015;31:274–80.
6. Maunakea aK, nagarajan rP, Bilenky M, et
al. conserved role of intragenic Dna methylation in regulating alternative
promoters. Nature 2010;466:253–7.
7. Zhang M, Wang J. epigenetic regulation
of gene expression in osteoarthritis. Genes Dis 2015;2:69–75.
8. Lehrke M, lazar Ma. The many faces of
PParγ. Cell 2005;123:993–9.
9. Ratneswaran a, sun MM-G, Dupuis H, et
al. nuclear receptors regulate lipid metabolism and oxidative stress markers in
chondrocytes. J Mol Med 2017;95:431–44.
