磷酸化蛋白plus 2.0

      蛋白質磷酸化(Proteinphosphorylation)是生物界最普遍，也是最重要的一種蛋白質轉譯後修飾(Posttranslationalmodifications，PTMs)，20世紀50年代以來一直被生物學家看作是一種動態的生物調節過程。在細胞中，大約有1/3的蛋白質被認為是經過磷酸化修飾的[1]。在人類基因組中，大約有2%的基因編碼了500種激酶(kinase)和100種磷酸酶（phosphatase） [2]。蛋白質磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物細胞表現調控的關鍵環節，對許多生物的細胞功能起開關調控作用，是一種普遍的重要調節機制。因此，蛋白質磷酸化的分析和磷酸化位點的鑑定已成為目前蛋白質體學研究的重點之一。

蛋白質磷酸化的主要類型 

      酸化蛋白質根據其磷酸氨基酸殘基的不同大致可分為四類，即:O-磷酸鹽、N-磷酸鹽、酰基磷酸鹽和S-磷酸鹽。 O-磷酸鹽是通過羥氨基酸的磷酸化形成的，如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，羥脯氨酸或羥賴氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸鹽是通過精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸鹽是通過天門冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸鹽通過半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白質磷酸化的功能

(1)磷酸化參與酶作用機制，在此過程磷酸化為反應性中間產物(多為S-或N-磷酸鹽)，如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依賴的磷酸轉移酶系統(PTR )的組氨酸蛋白激酶(HPr)；

(2)磷酸化介導蛋白活性，蛋白分子通過蛋白激酶發生磷酸化，如蛋白激酶A(絲氨酸和蘇氨酸殘基)或不同的受體酪氨酸激酶(酪氨酸殘基)；

(3)天門冬氨酸、麩胺酸和組氨酸的磷酸化在細菌趨化反應傳導中發生解離。

蛋白質磷酸化的分子機制

      蛋白質的磷酸化和去磷酸化過程調節著細胞信號轉導、細胞分化和細胞生長等幾乎所有的生命活動過程，因此，被生動形象的描述為細胞生理活動的分子開關。蛋白質在蛋白激酶作用下發生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可識別和修飾不同蛋白質的不同位點。這就擴大了磷酸化蛋白質研究的複雜性，從而使磷酸化蛋白質成為蛋白質翻譯後修飾研究的熱點。

大量實驗：
改變生物的生長環境，可誘導出生物體內的蛋白質磷酸化現象的發生，從而導致細胞內蛋白質的組成和數量發生變化，最終使生物體的生理狀態發生改變。因此，當細胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑製或過表達時，蛋白質磷酸化過程就會雜亂，從而導致細胞週期調控異常。因此，腫瘤的形成與蛋白質的磷酸化異常有很大相關性。換句話說，蛋白質磷酸化的分子機制對於癌症等重大疾病的研究具有相當的指導意義。這也就使其成為生物學研究領域中的熱點。

[ 1 ] Zolnierowicz S , Bollen M. protein phosphorylation and protein phosphatases [J ] . De Panne , Belgium , 1999 , Sep , 12 - 24.EMBO J , 2000 ,19 :483 - 488.

[ 2 ] Mann M, Ong S E , Gronborg M, et al. Analysis of protein phosphorylation using mass Spectrometry : deciphering the phosphoproteome[J ] . Trends Biotechnol , 2002 ,20 :261 - 268.

常見問題

1、如何鑑定蛋白的磷酸化位點？具體而言就是常用的網站有哪些？通過哪些實驗能比較容易的確定這些磷酸化位點？

對於蛋白修飾性位點的預測還是有很多網站的，首先我們看看常用查詢蛋白信息的數據庫：

Uniprot：

http://www.uniprot.org/

        UniProt 是 versal ein 的英文縮寫，是信息最豐富、資源最廣的蛋白質數據庫。它由整合Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大數據庫的數據而成。他的數據主要來自於基因組測序項目完成後，後續獲得的蛋白質序列。它包含了大量來自文獻的蛋白質的生物功能的信息。

以“AKT1”為例：

PTM / Processing：可以查到修飾位點，酶及文獻鏈接，各位點的生物學功能 

樣本表達：

再來，三個數據庫簡單介紹給大家：

Swiss-Prot

http://expasy.org/sprot/

        SWISS-PROT數據庫包括了從EMBL翻譯而來的蛋白質序列，這些序列經過檢驗和註釋，該數據主要由日內瓦大學醫學生物化學系和歐洲生物信息研究所（EBI）合作維護。

SWISS-PROT中的數據來源於不同的源地：

（1）從核酸數據庫經過翻譯推導而來
（2）從蛋白質數據庫PIR挑選出合適的數據
（3）從科學文獻中摘錄
（4）研究人員直接提交的蛋白質序列數據

註釋包括： 

 A:蛋白質的功能描述； 

 B:翻譯後修飾； 

 C:域和功能位點，如鈣結合區域、ATP結合位點等； 

 D:蛋白質的二級結構； 

 E:蛋白質的三級結構，如同構二聚體，異構三聚體等； 

 F:與其他蛋白質的相似性； 

 G:由於缺乏該蛋白而引起的疾病；  

H:序列的變化； 

        SWISS-PROT雖好，但其數據存在一個問題，即把EMBL的DNA序列準確地翻譯成蛋白質序列並進行註釋需要時間。一大批含有開放閱讀框的的DNA序列尚未列入SWISS-PROT。所以，TrEMBL數據庫被建立起來了。

TrEMBL

http://www.bioinfo.pte.hu/more/TrEMBL.htm

        TrEMBL數據庫 是與SWISS-PROT相關的一個資料庫。包含從EMBL核酸數據庫中根據編碼序列（CDS）翻譯而得到的蛋白質序列，並且這些序列尚未集成到 SWISS-PROT數據庫中。

TrEMBL有兩個部分：

(1):SP-TrEMBL：包含最終要集成到SWISS-PROT的數據，所有的SP- TrEMBL都已被賦予SWISS-PROT的登錄號。
(2):REM-TrEMBL：包括所有不準備放入SWISS-PROT的數據，因此這部分數據沒有登錄號。

PIR蛋白質資料庫

http://www.proteininformationresource.org/pirwww/index.shtml

         PIR數據庫的數據最初是由美國國家生物醫學研究基金會（National Biomedical Research Foundation, NBRF）收集的蛋白質序列，主要翻譯來自GenBank的DNA序列。能夠幫助研究者鑑別和解釋蛋白質序列信息，研究分子進化、功能基因體。是一個全面的、經過註釋的、非redundant的蛋白質序列資料庫。所有的序列都經過整理，超過99%的序列已按蛋白質家族進行分類，一半以上按蛋白質超家族分類。

其他推薦網站

名稱	網址	描述
Phosphosite	https://www.phosphosite.org/homeAction.action	磷酸化位点数据库
PROSITE	http://www.expasy.ch/prosite/	含有蛋白质翻译后修饰信息
HPRD	http://www.hprd.org/	人类蛋白质的综合信息数据库，含有很多翻译后修饰的信息
dbPTM	http://dbptm.mbc.nctu.edu.tw/	翻译后修饰数据库
PREDIKIN	http://predikin.biosci.uq.edu.au/	预测翻译后修饰激酶工具
NetPhos	http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/	预测磷酸化的工具
NetPhosK	http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/	预测磷酸化和磷酸化激酶的工具
GPS	http://gps.biocuckoo.org/	预测磷酸化和磷酸化激酶的工具
Big-PI-prediction	http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html	预测GPI的工具
O-GlycBase	http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/	O-糖基化数据库
GlycoMod	http://www.expasy.ch/tools/glycomod/	预测糖基化的工具
NetOGlyc	http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/	预测O-糖基化的工具
NetNGlyc	http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/	预测N-糖基化的工具
YinOYang	http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/	预测O-β-GlcNAc附着位点的工具
Sulfinator	http://www.expasy.org/tools/sulfinator/	预测硫基化工具（Tyrosine 修饰）

2、做細胞信號通路研究，無法查到相關的資料，即蛋白磷酸化發揮功能結束後，該蛋白是磷酸化，還是降解呢？ 

      信號通路依靠的就是信號蛋白上磷酸基團的傳遞，一般都是多級激酶模式，磷酸化激酶作用於下游蛋白（可能是激酶可能是轉錄因子），將磷酸基團傳遞給下游蛋白，使其磷酸化，但同時又會被上游的激酶磷酸化，所以從表觀上來看，通路激活時，某蛋白的磷酸化水平居高不下，可保持一段時間，甚至可以說磷酸化程度越高，通路激活越充分，但其發揮作用後是去磷酸化的。當然事情也不是絕對的，如果有某些特定的信號蛋白是發揮作用後降解的，也是有可能的，但尚不清楚有還是沒有，這裡所表達的是普通信號蛋白的工作原理。

常見FAQ

1.  確定樣本中磷酸化蛋白的表現量？

      對的樣本，正確的處理方法和合適的positive control是實驗成功的第一步。

對的樣本：實驗前需先查閱文獻或通過預實驗檢測該樣本是否表達，若該樣本根本就不表達目的蛋白，那就不要浪費感情了吧；

正確的處理方法：若正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達，可通過物理或化學方法進行一定的刺激和誘導，刺激條件各不相同。但這並不代表刺激越多越好，充分但不過分（如磷酸化IRS1，僅需刺激5min，刺激過久會進入負反饋機制進而開始降解）的正確刺激會幫助得到最佳實驗結果；

合適的陽性對照：在任何實驗中，我們都應考慮包含適當的positive和negative control，可使您進一步確定抗體檢測到的特異性訊號。

2.  總蛋白和內參對照都要做？

      普通的internal control如Actin、GAPDH等和總蛋白抗體的對照都要做嗎？

      對，都要做！普通的internal control可以作為體系的對照，保證上樣的量一致從而排除體系本身的影響，對於結果分析比對十分重要。

      同時，總蛋白抗體也必不可少，僅僅是檢測到磷酸化蛋白表現量的增加並不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加了才能說明磷酸化水平增加，這種表述實驗結果的方法是最客觀的，也是必需的。

3.  確保完全裂解lysis並使用新鮮樣本

      相對於僅用裂解緩衝液裂解，裂解液裂解+sonication處理可確保整個細胞充分裂解並打斷染色質DNA。建議在35%-40%的功率輸出條件下超聲3次，每次10s。由於不同儀器不同性能，請根據生產商的建議進行優化。 超聲處理時應保持低溫，冰上操作。如果您沒有探頭sonicator，用細的注射器針頭反復吹打也能起到類似的作用。在得到樣品後，請不要反覆凍融，建議-80℃冰箱分裝保存。

4.  小心蛋白殺手

      組織或細胞lyse時會釋放出大量endogenous蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導致不同於正常生理狀態的差異。因此，在lysis buffer中加入蛋白酶抑製劑和蛋白磷酸酶抑製劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護蛋白質的磷酸化狀態，非常重要。否則band很淺不說，結果可信度還不能保證。

注意：使用PMSF時要新鮮配置。

5.  樣品低溫處理

      除超聲時保持低溫，在做磷酸化蛋白的整個實驗過程中都要保證低溫環境。磷酸化蛋白在室溫條件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑製劑也很明顯。所以務必要保持！低溫！環境！

6.  用5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1h

      磷酸化抗體不適於用牛奶封閉的說法是沒有科學依據的。這一誤區的出現可能是由於實驗者使用了非實驗級奶粉引起的（許多奶粉含有磷酸酶等雜質）。 ABclonal建議transfer後迅速在TBS中wash幾秒，以便移除殘留的transfer buffer，隨後使用5%脫脂牛奶（請使用實驗級）的TBST室溫blocking 1h，這一封閉步驟有助於降低非特異性一抗結合併降低background。 另外應避免blocking時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結合。 ABclonal建議所有抗體均應如此。 ABclonal科學家生產驗證每一支上市的抗體的每一種應用，顯然更懂得如何讓抗體表現出最佳的狀態。blocking完後，incubate一抗前最好在TBST中wash 5min。

7.  磷酸化和總蛋白抗體到底怎麼孵育？

      一般磷酸化和總蛋白的band位置基本是一樣的，所以如果樣品比較珍貴或有限的情況下，可以在壓完磷酸化抗體後，將膜strip後再壓總蛋白抗體，stripping的時候注意溫度盡量控制在50℃以內。不過ABclonal的做法是建議在樣品充足的情況下同時跑兩塊膠，比strip效果會更好。

8.  4℃條件過夜incubate一抗

      抗原抗體之間是一種非共價的結合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會變弱，容易脫落，因此，首先保證4℃抗體incubation條件非常重要。其次要保證抗原和抗體相互磨合incubation的時間，磷酸化蛋白只佔總量的極少部分，過夜可保證充分結合進而曝出更漂亮的條帶。哪怕不是磷酸化蛋白，ABclonal也推薦4℃ incubation overnight，讓結果呈現最好的一面。

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